围炉“液”话: 从基础到临床,重新认识循环肿瘤细胞检测

更新时间:2016-08-08 09:09:24 作者:admin点击次数:

2016-08-02 小松鼠 转化医学网
“液态活检”是目前国际、国内精准医疗方面最火热的话题之一,循环肿瘤细胞(CTC)是最早开展的液体活检领域,CellSearch更是在2004年和2012年分别获得了FDA和SFDA批准用于中晚期肿瘤的监测。目前CTC的检测从阳性富集到阴性筛选,从免疫荧光、FISH到微流控,从单纯的细胞计数到细胞分型,百家争鸣、百花齐放,各路资金更是“挥钱如雨”,整个行业灼热异常。可与之相反的是,目前所有的CTC检测技术在临床检测中泛善可陈,临床使用价值仍有待商榷。如何解开这个技术与市场、检验与临床的“结”,真正使CTC能够成为临床重要的辅助检测技术,是目前亟待解决的问题。

  近日“复旦现代病理中心”诚邀病理、检验、临床老师们一起, “围炉液话”,我们围着的是对CTC检测技术临床应用前景炽热的希望;我们冷静地分析“临床医生期望通过CTC获得什么样的信息,能够揭示肿瘤的复发转移规律,让肿瘤患者在临床治疗中获益”;希望这种坦诚的交流能够帮助市场摆脱“剃头挑子一头热”的尴尬,把临床应用的热情也燃起来,让这项技术真正成为医生的辅助诊断手段,为患者带去福音。

  颜宏利教授:液体活检是一个非常火热的领域,它在临床上有一个很大的需求,但目前在临床上的应用却不是很广泛。自09年我从美国回来以后,就开始做关于CTC和ctDNA的检测研究,由于时代的局限性,CTC相关的富集技术及鉴定技术虽然取得了长足的进步,但是还不成熟,在临床上的应用与临床医生的期望有一定差距。在临床上,医生们觉得CTC检测技术使得对肿瘤患者进行疗效的快速评估及复发早期预警成为可能,肿瘤病人也很希望能够通过可靠的CTC技术获益。然而,由于原先CTC技术还不完善,落地到临床还需要走很长的一段路。因此,我们请到了复旦基础医学院病理系主任朱虹光教授、上海第六人民医院肿瘤内科主任沈赞教授围炉“液”话--围绕CTC、ctDNA来讨论当下火热的液体活检,我们的临床医生到底需要的是怎么样的CTC检测技术,目前在技术上是否有实现及完善的可能。

  朱老师您是怎么看待CTC检测相关技术以及CTC技术临床应用的问题?

  朱虹光教授:
  CTC检测有两个关键的系统。

  第一个最重要也是最核心的系统就是CTC细胞的鉴定系统。CTC技术应用于临床,首先要保证从血液中富集到的是肿瘤细胞,如果不能保证是肿瘤细胞,那么之后再做的一切都是没有意义的。对富集到的有核细胞进行辨识鉴定,必需要解决一个问题:哪些是肿瘤细胞、哪些不是肿瘤细胞,必需区别开来。

  第二个关键系统是富集,我们知道,肿瘤细胞一旦离巢进入脉管系统(血液循环及淋巴循环),会发生不同的变化和转归,从形态上来讲,有单个细胞存在的CTC或细胞团存在的循环肿瘤微栓子(CTM),从型别上来讲,有上皮型CTC、间质型CTC及混合型CTC三种型别。在CTC富集上,就要求完整地富集到整个CTC细胞的细胞谱。

  这应该是循环肿瘤细胞检测技术需要解决的核心问题,只有完善了这两个系统,循环肿瘤细胞检测从技术层面上来讲就初步成熟,这也是循环肿瘤细胞检测进入临床的大前提。用通俗的话来讲:“只有能够完整的富集到整个CTC细胞谱,并对富集到的细胞进行精准辨识判定并分型的CTC检测技术才是临床能够使用的。”

  复旦现代病理中心很早就对CTC进行了相关研究,最早的时候,我们捕获CTC是通过正向富集的技术-通过免疫磁珠的方式(上皮标记物标记在磁珠上)来捕获CTC,但是对于去上皮化而间质化的CTCs(恶性程度最高的CTC)无法捕获,对于处于混合状态的CTC(发生EMT转变,即上皮-间质转化)捕获率大幅下降,所以造成CTC捕获率十分不稳定。后来通过负向富集,也就是首先将红细胞裂解,再利用白细胞特异性表达的抗原,用负性磁珠将白细胞去除。但是后来我们发现,有些CTCs也会表达白细胞的抗原(免疫伪装),因此负向去除时就会将产生免疫伪装的CTCs也去除掉,造成检出率下降。所以我们得出了一个结论,所有依赖细胞生物标志的分离、富集、捕获方法均无法达到我们目前对CTC检测的要求。

  随着纳米材料科学的进步,通过分子筛的方法富集CTC细胞的方法得以实现,分子筛能够截留下大直径的有核细胞,进一步通过细胞核染色(DAPI),确认出核异型细胞,然后通过分子病理学的方法,对目标细胞的特异性上皮标记物及间质标记物经行鉴定,从而确定是否是循环肿瘤细胞,并同时对CTCs实现分子分型,实现CTCs的EMT分子分析,实现有生物学活性CTCs的可视化分子检测(形态学观察+分子鉴定),实现基于CTCs的DNA、mRNA、FISH、干细胞分析等多种CTCs下游应用。

  这是我们复旦现代病理中心这几年对CTCs进行相关研究实验,并最后确认CTCs检测的方向后制定的CTCs检测技术流程和要求。

  而肿瘤细胞的分子分型对肿瘤病人预后的研究非常多,发生EMT转变的CTC(混合型)比例越高,说明肿瘤的侵袭力越强、抵抗药物作用的能力越强,间质型的CTC比例越高,肿瘤的恶性程度越高,患者的预后越差。

  目前有很多研究CTC的团队,每个团队都有自己的CTC研究平台,有趣的是每个CTC研究的团队的背景都不一样,有搞生物医学的、有搞材料学的、也有我们广大的临床医生。每个平台的检测标准和鉴定系统还不一样,作为一个老病理人,我在这里想强调的是:“判断一位患者外周血里的细胞,是不是肿瘤细胞,是一件非常“严重”的事情!”请允许我用严重这个词。对于肿瘤患者来讲,是不是肿瘤细胞,这个判断是不能随便下的,因为这直接影响到的是患者个人、家庭及临床医生对下一步诊疗计划的制定,这是不是一件严重的事情?所以技术可以百家争鸣、百花齐放,但是对于CTC的鉴定,一定不能乱来,一定要遵循细胞病理学诊断对肿瘤细胞判断的金标准(核型控制),不能乱来。

  沈教授有非常丰富的肿瘤治疗的临床经验,目前很多临床的专家教授对CTC检测非常期许,我们请沈教授讲讲,我们临床医生对CTC检测的期望是什么,需要他解决临床工作中的那些痛点问题。

  沈赞教授:谢谢朱教授的精彩介绍,目前临床上有很多的CTC检测技术和平台,作为一个临床工作的研究者,说实话,对CTC的理解还停留在理论层面,没有涉及到具体的基础研究中来。听了朱教授的讲解,真的犹如揭开了CTC检测的面纱,让我对CTC检测有了清楚的认识和界定,对我们CTC的知识体系真正起到了“正本清源”的作用,受益匪浅。

  我作为一个肿瘤科的临床医生,对CTC十分关注,临床医生都希望有一个靠谱的CTC检测技术,能够填补目前肿瘤临床治疗中的空白问题。

  我们知道,90%肿瘤患者的死因都是肿瘤的复发和转移,针对肿瘤的复发转移,临床缺乏一个及时有效的预警方法,这个方法要能够足够早,现在的评价手段是影像学检查,而我们都知道,影像学的发现是非常滞后的,当临床上有表现或影像学有发现的时候,肿瘤患者已经失去了最佳的治疗时机,时间对于肿瘤患者来讲是最宝贵的。

  第二个痛点问题是,我们目前对肿瘤患者进行的治疗,包括手术、化疗、放疗等等,在消灭肿瘤的同时,对患者本身也有非常大的伤害,作为一个医者,我们临床医生急需一个工具,能够对患者目前进行的肿瘤治疗是否有效进行早期快速的评估,在这一点上,肿瘤治疗领域一直是个空白,快速疗效评估可以让我们知道目前的有创(手术、化疗、放疗)治疗对患者是否有效,及时换药或终止无效的有创治疗。

  我作为一个肿瘤科的医生,这几年也接触了不少CTC检测技术和方法,一方面充满期待,另一方面充满了疑虑。为什么会对CTC技术持有疑虑呢?是因为CTC技术不够可靠!原谅我在这里用了“不可靠”,这里不是否定研究者们的努力,但是作为一名“医者”,当一个技术还不完善甚至于会误导临床诊疗的时候,是不能用于临床的。只有当这个技术完善了以后,真正从理论走向成熟,才能让患者收益。

  原先的CTC检测技术没有明确的指向性。事实上,作为一个临床医生,谁都想在肿瘤病人没有转移之前知道肿瘤什么时候会转移。如果CTC很可靠,并且某一种CTC表达谱与肿瘤转移的关系被确定,那么这不仅对临床医生,而且对病人来讲,都有巨大的意义。

  那么,现在的CTC平台能否做到可靠和明确指向性呢?或者说如何向需求的目标靠近?

  这就需要检验、病理、临床等一起努力来达成目标。当CTC分型明确,CTC表达谱与不同类型癌症或同一癌症不同分子分型明确对应起来,那么CTC技术成熟应用与临床且明确指导肿瘤预后的时代就已经到来。所以我同意朱老师观点,CTC检测系统中分子分型,能完整看到EMT变化,临床医生才有可能对循环系统中复发、转移实现监控和研究。

  颜宏利教授:我之前做过肠癌的研究,发现同一种肠癌有不同的CTC分子分型,不同的CTC分型产生的CTC数量不同,这项研究已经被《clinical cancer research》接收。因此,我认为在我们有一个统一平台之后,制定统一的检测鉴定标准,对不同肿瘤需要做一些大数据,根据数据来研究CTC分子分型是否与复发转移有关系。

  另一方面,肿瘤具有异质性,CTC同样也具有异质性。血液即扮演人体保护的作用,同时也是人体的一个垃圾桶。血液中人体排出的细胞,有的可能是即将死亡的细胞,就不容易存活;而有的可能抱成团,就可能引起转移。因此将CTC进行深层次细分,比如将即将凋亡的CTC和容易引起转移的CTC分开。现在有一种技术能够检测CTM(循环肿瘤微栓),而CTM可能是几个CTC抱成团,也可能是一个CTC与巨噬细胞等其他细胞抱成团,这样的细胞团就更能促进肿瘤的转移,新英格兰杂志也提到了这个问题。那么,朱老师,基于CTC的分子分型在临床上究竟具有那些重要的意义?

  朱虹光教授:CTC的分子分型在临床上非常重要。

  首先,前面讲到细胞核形态+细胞分子分型能帮助我们鉴定这是不是CTC,不同分子分型的CTC生命力、侵袭力、耐药能力各不相同。

  其次,CTM的预后肯定是不好的。早期癌症的血液中大量的CTC可以被NK细胞杀死,然而抱成团的CTM就可能躲过NK细胞的追杀,从而引起转移。CTC单细胞表达谱可能都不一样。比如从一个病人的血液中挑出10个CTC,这些CTC的表达谱可能各不相同。但如果能够完成大量CTC单细胞表达谱,那么就可以根据这些数据和我们的现在分子分型结合分析,建立数据库一一对应分析。这样肯定有利于对癌症病人的治疗和监管。

  颜宏利教授:最早批准的CTC平台--CellSearch适合检测的肿瘤类型有肠癌、乳腺癌和前列腺癌。朱教授,随着我们现在对CTC的认识更加深入,技术手段的不断完善,现在的CTC平台,比如第二代CTC检测平台,适合用于哪些肿瘤的监测?或者说哪些肿瘤患者血液中的CTC数量更多,更容易检测?

  朱虹光教授:目前针对所有的实体瘤,只要是会发生血行转移的,基于我前面提到的技术路线,抓住CTC的共性,在我们实验室,基本都能有效捕获并分型。哪些肿瘤引起的CTC数量更多,这种富集检测方法更适用于哪种肿瘤的检测,还是需要我们临床专家的加入,从理论上讨论可行性,在临床工作中进行验证,这才是严谨的做法。

  沈赞教授:我非常同意朱教授讲的,像乳腺癌发病率较高,有些类型的乳腺癌在早期发生转移的机会也比较大。我自己除了关注上皮来源的一些肿瘤CTC外,目前更集中在骨软组织肉瘤上。肉瘤有一个特点,它属于筋膜来源细胞,有一个间质上皮转化的转移过程。肉瘤比较容易进入血液,那么CTC技术是否能检测到转移之前的肉瘤CTC,如何找到肉瘤CTC的特异性抗体,找到的CTC中有哪些是容易转移的。这些研究比较少。

  再例如:骨肉瘤。骨肉瘤对化疗比较敏感,大部分患者术前和术后都需要进行化疗,术前大概化疗8次。然而有1/3的骨肉瘤患者对化疗不敏感,那么我们就可以通过监测化疗前后血液中的CTC来决定病人是否需要急需化疗。

  这些都是临床亟待解决的问题。

  颜宏利教授:临床医生对CTC技术感兴趣的原因就包括对化疗疗效的评估,这也是CTC最有魅力的原因之一。另外,CTC作为辅助手段,是否可以和其它检测方法联合应用,比如影像、其它分子标记物、ctDNA。最早大家比较关注CTC,但因为其捕获和检测技术没有达到预期的可靠性。国际上对ctDNA研究比较多。那么,朱老师、沈教授您们怎样看待CTC和ctDNA之间的关系?

  沈赞教授:我的理解,ctDNA可能避开了CTC本身检测准确率的问题。ctDNA用于检测已知癌症突变基因,例如肺癌分子分型诊断。在肺癌晚期,分子分型诊断尤其重要,根据分子分型选择副作用低的靶向药物。对于一些丢失原发病灶病理的患者和拒绝穿刺的患者,ctDNA也可以作为有效补充。

  朱虹光教授:ctDNA对于靶向治疗的选择是一个有效的手段,但ctDNA检测的癌症突变仅占基因突变的很少一部分。CTC抓取的是肿瘤细胞,ctDNA则是根据能够进行靶向治疗的基因突变来“抓取”的,这两者不能够互相取代,但两者都是病理检测以后动态监测的补充。